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SDS-PAGE


SDS-PAGE (Abkürzung für englisch sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) ist eine Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese, einer analytischen Methode der Biochemie zur Trennung von Stoffgemischen nach der Molekülmasse in einem elektrischen Feld.

Dieses von Ulrich K. Laemmli entwickelte diskontinuierliche elektrophoretische System ermöglicht eine gute Trennung der Proteine mit Molekülmassen zwischen 5 und 250 KDa.[1] Die Publikation, in der es beschrieben wurde, ist das am häufigsten zitierte Paper eines Einzelautors, und das zweithäufigst zitierte insgesamt.[2]

Einsatzbereich

Die SDS-PAGE wird zur Analyse von Proteinen verwendet. Als Trennmedium (auch als Matrix bezeichnet) bei dieser Art der Elektrophorese dient ein diskontinuierliches Gel auf Polyacrylamidbasis. Zusätzlich kommt SDS (Natriumdodecylsulfat) zum Einsatz. Dieses anionische Tensid (Detergens) überdeckt die Eigenladungen von Proteinen. Pro Gramm Protein binden konstant ungefähr 1,4 Gramm SDS,[3][4] entsprechend einem SDS-Molekül pro zwei Aminosäuren, sodass die Proteine eine konstante negative Ladungsverteilung aufweisen. Die negativen Ladungen des SDS führen zu einer gegenseitigen Abstoßung, was zusammen mit der Denaturierung durch Aufkochen zu einer Linearisierung der zuvor gefalteten Proteine führt. Dies erlaubt eine Auftrennung nach der Kettenlänge, proportional zur Molekülmasse, denn die längeren Proteine werden im Gel stärker zurückgehalten als kürzere Proteine. Das SDS umgibt das linearisierte Protein mit einer näherungsweise ellipsoiden Hülle. Die Eigenladungen der Proteine sind unter der SDS-Beladung vernachlässigbar, die positiven Ladungen sind zudem im basischen pH-Wert-Bereich eines Trenngels nach Laemmli stark verringert. Alternativ kann teilweise auch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit den kationischen Tensiden CTAB in einer CTAB-PAGE[5][6][7] oder 16-BAC in einer BAC-PAGE verwendet werden.[8]

Verfahren

Das Verfahren der SDS-PAGE setzt sich aus der Gelherstellung, der Probenvorbereitung, der Elektrophorese, der Proteinfärbung oder einem Western Blot und der Analyse des erzeugten Bandenmusters zusammen.

Gelherstellung

Bei Verwendung unterschiedlicher Puffer im Gel (diskontinuierliche Gelelektrophorese) werden die Gele bis zu einen Tag vor der Elektrophorese hergestellt, damit die Diffusion nicht zu einer Vermischung der Puffer führt. Das Gel wird durch radikalische Polymerisation in einer Form erzeugt, die aus zwei abgedichteten Glasplatten mit Abstandshaltern zwischen den Glasplatten besteht. Die Abstandshalter besitzen eine Dicke von 0,75 mm oder 1,5 mm, welche die Ladekapazität des Gels bestimmt. Die Platten werden meistens für das Gießen der Gellösung in einen Ständer eingespannt, der die sonst offene Unterseite der Glasplatten mit den beiden Abstandshaltern vorübergehend abdichtet. Für die Gellösung werden Acrylamid als Gelbildner (meistens 4 % V/V im Sammelgel und 10–12 % im Trenngel), Methylenbisacrylamid als Quervernetzer, Sammel- oder Trenngelpuffer sowie Wasser und SDS gemischt. Durch Zugabe des Katalysators TEMED und des Radikalstarters Ammoniumpersulfat (APS) wird die Polymerisation begonnen. Die Lösung wird anschließend blasenfrei zwischen die Glasplatten gegossen. Je nach Menge an Katalysator und Radikalstarter sowie je nach Temperatur dauert die Polymerisation zwischen einer viertel Stunde und mehreren Stunden. Das untere Gel (Trenngel) wird zuerst gegossen und mit ein paar Tropfen von einem wenig wasserlöslichen Alkohol (meistens puffergesättigtes Butanol oder Isopropanol) überschichtet, wodurch der Meniskus blasenfrei wird und vor dem Radikalfänger Sauerstoff geschützt wird. Nach der Polymerisation des Trenngels wird der Alkohol abgekippt und die Reste mit Filterpapier entfernt. Nach Zugabe von APS und TEMED zur Sammelgellösung erfolgt das Gießen der Sammelgellösung auf das feste Trenngel und das blasenfreie Einsetzen eines geeigneten Probenkamms. Der Probenkamm wird nach der Polymerisation vorsichtig herausgezogen, wodurch Taschen für den Probenauftrag entstehen. Für eine spätere Verwendung der Proteine für eine Proteinsequenzierung werden die Gele oftmals am Vortag der Elektrophorese hergestellt, um Reaktionen von unpolymerisiertem Acrylamid mit Cysteinen in Proteinen zu mindern.

Durch Verwendung eines Gradientenmischers können Gele mit einem Gradienten des Acrylamids (meist von 4 bis 12 %) gegossen werden, die einen größeren Trennbereich der Molmassen aufweisen.[9] Kommerzielle Gelsysteme (so genannte pre-cast-Gele) verwenden meist die Puffersubstanz BisTris mit einem pH-Wert von 6,4 bis 7,2 sowohl im Sammel- als auch im Trenngel.[10][11] Diese Gele werden bereits fertig gegossen geliefert und sind umgehend einsatzbereit. Da sie nur einen Puffer verwenden (kontinuierliche Gelelektrophorese) und einen nahezu neutralen pH-Wert aufweisen, sind sie über mehrere Wochen lagerbar. Der neutralere pH-Wert verlangsamt die Hydrolyse und somit den Zerfall des Polyacrylamids.[12] Weiterhin kommt es zu weniger Acrylamid-modifizierten Cysteinen in den Proteinen.[10] Proteine in BisTris-Gelen können nicht mit Rutheniumkomplexen gefärbt werden.[13] Dieses Gelsystem besitzt einen vergleichsweise großen Auftrennungsbereich, der durch Verwendung von MES oder MOPS im Laufpuffer variiert werden kann.[10]

Probenvorbereitung

Bei der Probenvorbereitung wird SDS im Überschuss zu den Proteinen hinzugegeben und die Probe anschließend auf 95 °C erhitzt, um Sekundär- und Tertiärstrukturen durch das Unterbrechen von Wasserstoffbrücken und das Strecken der Moleküle aufzubrechen. Optional können Disulfidbrücken durch Reduktion gespalten werden. Dazu werden reduzierende Thiole wie β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT) oder Dithioerythrit (DTE) dem Probenpuffer zugesetzt. Am Ende dieser Präparation weisen die mit SDS beladenen linearisierten Proteine eine ellipsoide Form auf, da SDS in wässrigen Lösungen zur Bildung von kugelförmigen Micellen neigt. Wegen des starken Denaturierungseffekts und der folgenden Aufspaltung von Proteinkomplexen können in der Regel mit SDS keine Quartärstrukturen bestimmt werden. Ausnahmen bilden z. B. zuvor durch kovalente Quervernetzung stabilisierte Proteine und die sogenannten SDS-resistenten Proteinkomplexe, welche auch in Gegenwart von SDS stabil sind (Letztere jedoch nur bei Raumtemperatur). Die SDS-Resistenz basiert auf der Metastabilität. Um die resistenten Komplexe zu denaturieren, ist eine hohe Aktivierungsenergie erforderlich. Obwohl das native, vollständig gefaltete, SDS-resistente Protein unter den Bedingungen keine ausreichende Stabilität besitzt, stellt sich das chemische Gleichgewicht der Denaturierung nur langsam ein. Stabile Proteinkomplexe zeichnen sich neben der SDS-Resistenz auch noch durch Stabilität gegen Proteasen und eine erhöhte biologische Halbwertszeit aus.[14] Jede Probe wird in ihre eigene Tasche im Gel pipettiert, das zuvor im Elektrophoreseapparat in Elektrophoresepuffer untergetaucht wurde. Der Größenmarker wird oftmals in die erste oder letzte Tasche eines Gels pipettiert.

Elektrophorese

Zur Auftrennung werden die denaturierten Proben auf ein Gel aus Polyacrylamid geladen, das in einen Elektrophoresepuffer mit geeigneten Elektrolyten eingelegt ist. Danach wird eine elektrische Spannung (meist um die 100 Volt, 10–20 V pro cm Gellänge) angelegt, die eine Migration der negativ geladenen Moleküle durch das Gel in Richtung der Anode (Plus-Pol) bewirkt. Das Gel wirkt dabei wie ein Sieb. Kleine Proteine wandern relativ leicht durch die Maschen des Gels, während große Proteine eher zurückgehalten werden und dadurch langsamer durch das Gel wandern. Zusätzlich zu den Proben wird meistens ein Größenmarker auf das Gel geladen. Dieser besteht aus Proteinen von bekannter Größe und ermöglicht dadurch die Abschätzung der Größe der Proteine in den eigentlichen Proben, die parallel in unterschiedlichen Spuren des Gels wandern. Die Elektrophorese dauert je nach verwendeter Spannung und Länge des Gels zwischen einer dreiviertel Stunde und mehreren Stunden.

Das am häufigsten eingesetzte Verfahren ist die diskontinuierliche SDS-PAGE. Bei dieser wandern die Proteine zuerst in ein Sammelgel mit neutralem pH, in dem sie konzentriert werden und anschließend in ein Trenngel mit basischem pH, in dem die eigentliche Auftrennung erfolgt. Sammel- und Trenngel unterscheiden sich durch unterschiedliche Porengröße (4–6%T bzw. 10-20%T), Ionenstärke und pH-Werte (pH6,8 bzw. pH8,8). Als Elektrolyt wird häufig ein SDS-haltiges TRIS-Glycin-Chlorid-Puffersystem eingesetzt. Im Sammelgel wandern die kleineren Chloridionen vor den Proteinen (engl. leading ions ‚führende Ionen‘) und die etwas größeren, überwiegend auch positiv geladenen Glycinat-Ionen nach (engl. trailing ions ‚folgende Ionen‘), während im vergleichsweise basischen Trenngel beide Ionen vor den Proteinen wandern. Der pH-Gradient zwischen Sammel- und Trenngelpuffer führt zu einem Stapelungseffekt an der Grenze des Sammelgels zum Trenngel, da das Glycinat beim ansteigenden pH-Wert teilweise seine bremsende positive Ladung verliert und dann als zuvor folgendes Ion (Glycinat) die Proteine beim Wandern überholt. Zur Trennung von kleineren Proteinen und Peptiden eignet sich aufgrund der höheren Spreizung der Proteine im Bereich von 0,5 bis 50 KDa das TRIS-Tricin-Puffersystem von Schägger und von Jagow.[15]

Färbung

Am Ende der elektrophoretischen Trennung sind alle Proteine nach Größe sortiert und können anschließend durch weitere Verfahren (Proteinfärbungen wie z. B. die Coomassiefärbung, die Silberfärbung, die Stains-all-Färbung, die Amidoschwarz 10 B-Färbung, die Fast-Green-FCF-Färbung, die fluoreszenten Färbungen wie die Epicocconon-Färbung und die SYPRO-Orange-Färbung sowie immunologische Nachweise wie z. B. beim Western Blot) sichtbar gemacht werden.[16][17][18] Die fluoreszenten Färbungen besitzen eine vergleichsweise höhere Linearität zwischen Proteinmenge und Farbintensität von etwa drei Zehnerpotenzen oberhalb der Nachweisgrenze, d. h. man kann ungefähr aus der Farbintensität die Menge an Protein abschätzen. Bei einer Verwendung des fluoreszenten Proteinfarbstoffs Trichlorethanol entfällt eine nachträgliche Proteinfärbung, wenn es zur Gellösung hinzugefügt wurde und das Gel nach der Elektrophorese mit UV-Licht bestrahlt wurde.[19][20]

Analyse

Durch eine Proteinfärbung erhält das Gel mit den getrennten Proteinen ein dokumentierbares Bandenmuster der verschiedenen Proteine. Glykoproteine adsorbieren SDS an den Glykosylierungen ungleichmäßiger, was in breiteren und unschärferen Banden resultiert. Membranproteine sind wegen ihrer Transmembrandomäne häufig aus den hydrophoberen Aminosäuren aufgebaut, besitzen eine geringere Löslichkeit in wässrigen Lösungen, neigen zur Bindung von Lipiden und neigen aufgrund hydrophober Effekte zum Ausfallen in wässrigen Lösungen, wenn nicht ausreichend Detergens vorhanden ist. Dieses Ausfallen äußert sich bei Membranproteinen in der SDS-PAGE in einer „Schweifbildung“ oberhalb der Bande des Transmembranproteins, dagegen kann mehr SDS (durch Einsatz von mehr oder konzentrierterem Probenpuffer) verwendet und die Proteinmenge bei der Gelauftragung gemindert werden. Eine Überladung des Gels mit einem löslichen Protein äußert sich in einer halbkreisförmigen Bande dieses Proteins (z. B. in der Markerspur der Abbildung bei 66 KDa), wodurch andere Proteine mit ähnlichen Molmassen überdeckt werden können. Ein geringer Kontrast (wie in der Markerspur der Abbildung) zwischen den Banden innerhalb einer Spur deutet entweder auf das Vorhandensein vieler Proteine mit dazwischenliegenden Molmassen hin (geringe Reinheit) oder, wenn bei gereinigten Proteinen ein mangelnder Kontrast nur unterhalb einer Bande vorkommt, auf eine proteolytische Degradation des Proteins hin, die sich zuerst in Abbaubanden und nach weiterer Degradation auch in einer homogenen Färbung („Schmier“) unterhalb einer Bande äußert. Die Dokumentation des Bandenmusters erfolgt meistens durch Fotografieren oder Scannen. Zur anschließenden Rückgewinnung der Moleküle in einzelnen Banden kann eine Gelextraktion durchgeführt werden.

Archivierung

Nach der Proteinfärbung und Dokumentation des Bandenmusters kann das Polyacrylamidgel für eine Archivierung getrocknet werden. Proteine können daraus zu einem späteren Zeitpunkt extrahiert werden. Dabei wird das Gel entweder in einen Trockenrahmen (mit oder ohne Wärmezufuhr) oder in einen Vakuumgeltrockner eingelegt. Der Trockenrahmen besteht aus zwei Teilen, von denen einer als Unterlage für eine nasse Zellophanfolie dient, auf die das Gel und eine einprozentige Glycerollösung gegeben wird. Darauf wird eine zweite nasse Zellophanfolie blasenfrei aufgelegt, der zweite Rahmenteil aufgesetzt und der Rahmen mit ein paar Klammern abgedichtet. Die Entfernung der Luftblasen vermeidet eine Fragmentierung des Gels beim Trocknen. Das enthaltene Wasser verdampft durch die Zellophanfolie. Ein Vakuumgeltrockner erzeugt dagegen einen Unterdruck und erwärmt das Gel auf etwa 50 °C.

Molmassenbestimmung

Bei einer exakteren Bestimmung der Molmasse werden die relativen Laufweiten der einzelnen Proteinbanden im Trenngel gemessen. Die relative Laufweite (auch Rf-Wert, Rm-Wert) ist der Quotient aus der Laufweite der Bande des betrachteten Proteins und der Laufweite der Proteinfront. Die Laufweiten der Banden und der Proteinfront werden jeweils ab dem Beginn des Trenngels gemessen. Die Laufweite der Proteinfront entspricht ungefähr der Laufweite des im Probenpuffer enthaltenen Bromphenolblaus. Die relativen Laufweiten der Proteine des Größenmarkers werden halblogarithmisch gegen ihre bekannten Molmassen aufgetragen. Über Vergleich mit dem erzeugten Graphen oder rechnerisch durch eine Regressionsanalyse kann die Molmasse eines unbekannten Proteins anhand seiner relativen Laufweite ermittelt werden. Banden von Proteinen mit Glykosylierungen können unschärfer sein. Proteine mit vielen basischen Aminosäuren (z. B. Histone) können zu einer Überschätzung der Molmasse führen oder gar nicht erst ins Gel einwandern, da sie bei der Elektrophorese wegen der positiven Ladungen langsamer oder in die entgegengesetzte Richtung wandern. Entsprechend können viele saure Aminosäuren zu einer beschleunigten Wanderung eines Proteins führen.[21]

Varianten

Die SDS-PAGE ist die am meisten verwendete Methode zur gelelektrophoretischen Trennung von Proteinen. Die 2D-Gelelektrophorese kombiniert nacheinander eine isoelektrische Fokussierung oder eine BAC-PAGE mit einer SDS-PAGE. Die Nativ-PAGE wird eingesetzt, wenn die native Proteinfaltung erhalten bleiben soll. Zur Trennung von Membranproteinen kann alternativ zur SDS-PAGE eine BAC-PAGE oder eine CTAB-PAGE verwendet werden. Zur elektrophoretischen Trennung von größeren Proteinkomplexen kann eine Agarose-Gelelektrophorese eingesetzt werden, z. B. die SDD-AGE.

Literatur

Weblinks

Einzelnachweise

  1. U. K. Laemmli: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. In: Nature. Bd. 227, 1970, S. 680–685, doi:10.1038/227680a0 , PMID 5432063 .
  2. www.nzzfolio.ch: Interview mit Ulrich Lämmli . NZZ Folio, Nr. 11, 2005. Abgerufen am 4. März 2012.
  3. B. J. Smith: SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. In: Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). Band 1, 1984, S. 41–55, doi:10.1385/0-89603-062-8:41 , PMID 20512673 .
  4. Georgios Staikos, Anastasios Dondos: Study of the sodium dodecyl sulphate–protein complexes: evidence of their wormlike conformation by treating them as random coil polymers. In: Colloid and Polymer Science. 287, 2009, S. 1001, doi:10.1007/s00396-009-2059-3 .
  5. Engelbert Buxbaum: Cationic electrophoresis and electrotransfer of membrane glycoproteins. In: Analytical Biochemistry. Bd. 314, Nr. 1, 2003, S. 70–76, PMID 12633604 , doi:10.1016/S0003-2697(02)00639-5 .
  6. Dianne T. Akin, Raymond Shapira, Joseph M. Kinkade Jr.: The determination of molecular weights of biologically active proteins by cetyltrimethylammonium bromide-polyacrylamide gel electrophoresis. In: Analytical Biochemistry. Bd. 145, Nr. 1, 1985, S. 170–176, PMID 4003759 , doi:10.1016/0003-2697(85)90343-4 .
  7. R. J. Simpson: CTAB-PAGE. In: Cold Spring Harbor protocols. Band 2010, Nummer 4, April 2010, S. pdb.prot5412, doi:10.1101/pdb.prot5412 , PMID 20360366 .
  8. Joachim Hartinger, Katinka Stenius, Dagmar Högemann, Reinhard Jahn: 16-BAC/SDS-PAGE: a two-dimensional gel electrophoresis system suitable for the separation of integral membrane Proteins. In: Analytical Biochemistry. Bd. 240, Nr. 1, 1996, S. 126–133, PMID 8811889 , doi:10.1006/abio.1996.0339 .
  9. J. Margolis, K. G. Kenrick: 2-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. In: Nature. Band 221, Nummer 5185, März 1969, S. 1056–1057, PMID 5774398 .
  10. 10,0 10,1 10,2 J. P. Hachmann, J. W. Amshey: Models of protein modification in Tris-glycine and neutral pH Bis-Tris gels during electrophoresis: effect of gel pH. In: Analytical biochemistry. Band 342, Nummer 2, Juli 2005, S. 237–245, doi:10.1016/j.ab.2005.04.015 , PMID 15935323 .
  11. J. Wiltfang, N. Arold, V. Neuhoff: A new multiphasic buffer system for sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of proteins and peptides with molecular masses 100,000-1000, and their detection with picomolar sensitivity. In: Electrophoresis. Band 12, Nummer 5, Mai 1991, S. 352–366, doi:10.1002/elps.1150120507 , PMID 1718736 .
  12. A. Penna, M. Cahalan: Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. In: Journal of visualized experiments : JoVE. Nummer 7, 2007, S. 264, doi:10.3791/264 , PMID 18989435 , PMC 2565856 (freier Volltext) .
  13. J. Moebius, K. Denker, A. Sickmann: Ruthenium (II) tris-bathophenanthroline disulfonate is well suitable for Tris-Glycine PAGE but not for Bis-Tris gels. In: Proteomics. Band 7, Nummer 4, Februar 2007, S. 524–527, doi:10.1002/pmic.200600642 , PMID 17309097 .
  14. Marta Manning, Wilfredo Colón: Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. In: Biochemistry. Bd. 43, 2004, S. 11248–11254, PMID 15366934 .
  15. Hermann Schägger, Gebhard von Jagow: Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. In: Analytical Biochemistry. Bd. 166, 1987, S. 368–379, doi:10.1016/0003-2697(87)90587-2 , PMID 2449095 .
  16. S. Gallagher, D. Chakavarti: Staining proteins in gels. In: Journal of visualized experiments : JoVE. Nummer 17, 2008, ISSN 1940-087X , 760, doi:10.3791/760 , PMID 19066521 . PMC 3253607 (freier Volltext) .
  17. C. M. Wilson: Studies and critique of Amido Black 10B, Coomassie Blue R, and Fast Green FCF as stains for proteins after polyacrylamide gel electrophoresis. In: Analytical biochemistry. Band 96, Nummer 2, Juli 1979, ISSN 0003-2697 S. 263–278, PMID 89822 .
  18. C. M. Wilson: Staining of proteins on gels: comparisons of dyes and procedures. In: Methods in enzymology. Band 91, 1983, ISSN 0076-6879 , S. 236–247, PMID 6190068 .
  19. Carol L. Ladner, Jing Yang, Raymond J. Turner, Robert A. Edwards: Visible fluorescent detection of proteins in polyacrylamide gels without staining. In: Analytical Biochemistry Bd. 326, 2004, S. 13–20, PMID 14769330 .
  20. Jennifer E. Gilda, Aldrin V. Gomes: Stain-Free total protein staining is a superior loading control to β-actin for Western blots. In: Analytical Biochemistry Bd. 440, 2013, S. 186–188, PMID 23747530 .
  21. Y. Guan, Q. Zhu, D. Huang, S. Zhao, L. Jan Lo, J. Peng: An equation to estimate the difference between theoretically predicted and SDS PAGE-displayed molecular weights for an acidic peptide. In: Scientific reports. Band 5, 2015, S. 13370, doi:10.1038/srep13370 , PMID 26311515 , PMC 4550835 (freier Volltext) .

Kategorien: Elektrophorese

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